一次性無菌手術包使用前都已經進行消毒，手術器械和亞麻制品(如紗布、手術服和創巾)也都消毒清洗干凈。術后應盡可能用手或超聲波清洗機清洗器械和亞麻制品。通過高壓蒸汽或其他方法滅菌的物品(如環氧乙烷)必須用特殊的方法進行打包。打包是為了加強滅菌效果和無菌物品的保管。

一次性無菌手術包在打包前，器械應按照術者使用的順序分開擺放。如果使用蒸汽或氣體滅菌法，就應使用能被蒸汽或氣體穿透、不能滲透微生物、耐用且柔軟的包裹。

當包裹用蒸汽或氣體滅菌時，為保證氣體最大的穿透性，應遵從特殊的指導方法。用于蒸汽滅菌的包裹，滅菌前由兩層厚的軟棉布或非針織(即紙質)材料包裹。包裹(滅菌后立即使用的包裹需做適當冷卻處理)應用防水、隔熱的材料覆蓋，如果在滅菌后24h內使用則沒有這個必要。小件物品可使用可密封的隔熱紙或塑料袋進行包裹。采用氣體滅菌時，則用可密封的隔熱塑料袋、管子或棉布進行打包。當用電漿滅菌時，應該用密封、隔熱的特Ⅱ強聚酯薄膜袋子或聚丙烯袋進行包裹。還要注意蒸汽、環氧乙烷和干熱滅菌等方式推薦的時間、溫度和濕度。

一次性無菌手術包用蒸汽和氣體滅菌時，器械應放于有孔金屬器械托盤內的不含棉絨的(一種亞麻制品)毛巾上。如果使用帶鎖的盒子裝器械，高壓滅菌時應將盒子打開，方便蒸汽或氣體流通，器械間應有3～5mm的空隙。如可能的話，復雜的器械在滅菌前應拆卸開，電源設備在高壓前應涂潤滑油。如果器械有腔隙，在蒸汽滅菌前應用少量的水沖洗，水的汽化作用可迫使空氣排出空腔；相反，留在管內的水分在氣體滅菌器中會減少在滅菌臨界點下的氣體的活動。容器(如生理鹽水瓶)開口末端應向上或水平；帶有蓋子的容器應將蓋子稍微打開。多個容器之間應用毛巾隔開。每個包裹中都應該有足夠的手術紗布。在打包前，滅菌指示器應安置于每個包裹的中間。溶液應與器械分開，緩慢排除空氣，進行蒸汽滅菌。